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慢性淋巴細胞白血病SF3B1基因突變的全長轉錄本特

 
SF3B1是剪切體U2-snRNP的核心成分,其復發性體細胞突變與多種疾病有關,包括慢性淋巴細胞白血病(CLL)。使用Nanopore分別對CLL 分離的SF3B1野生型,突變株和正常組B細胞樣本進行全長轉錄組測序,并開發了一套分析流程。檢測到的3'末端剪接位點的差異,與以前的研究一致;還檢測到突變株內含子顯著性下調。全長轉錄組分析,可以將多個剪切事件關聯,可以更好評估二代數據無法評估的編碼異構體(編碼蛋白)和非編碼異構體(不編碼蛋白)。該工作證明了Nanopore測序在癌癥和可變剪切中的潛在使用價值。


研究背景

在癌癥中,剪切因子的突變與RNA前體剪切改變有關。特別是,SF3B1的復發性體細胞突變與多種疾病有關,包括慢性淋巴細胞白血病(CLL)、葡萄膜黑色素瘤、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征。SF3B1是剪切體U2-snRNP的核心成分,與mRNA前體的U2-snRNA和分支點A相關。在CLL中,SF3B1的HEAT-repeat domain的突變,如K700E熱點突變與不良的臨床結果相關。
SF3B1造成的Atm缺失的小鼠模型中表達SF3B1基因可以導致低外顯率的CLL,證明SF3B1突變在CLL的形成中起著驅動作用。此外,短序列測序的轉錄組測序證明,SF3B1的突變誘導了異常的剪切模式。突變株SF3B1已被證明能改變的3′末端剪切。對突變的SF3B1表達干擾,可以抑制腫瘤生長,進一步揭示了SF3B1的治療意義。
使用短讀長的轉錄組測序已經對SF3B1突變誘導的可變剪切(AS)模式進行了研究,但是并未在異構體層面進行分析。另外,短序列很難全面的反映外顯子之間的鏈接,對內含子保留定量是非常困難的,往往在分析的時候被忽略。
 
 



材料和方法

CLL患者腫瘤樣本中分離的3個野生型SF3B1(SF3B1WT),3個K700E突變(SF3B1K700E),以及3個正常組織分離的B細胞樣本。分別對每個樣品進行RNA提取,反轉錄成 cDNA后分別進行Nanopore PromethION(1D建庫)測序和二代轉錄組測序,同時對每組樣品進行一次Nanopore MinION(2D建庫)測序。同時,作者開發了一套算法,對數據進行分析。


研究結果

數據產出統計


Nanopore測序共產生257 M 的reads,其中30.5%為全長序列。數據的長度和已有其他報道的數據相似,保存了5年的RNA沒有顯示出明顯的降解跡象。MinION和PromethION基因表達Pearson相關性為0.82,因此數據可以進行后續分析。
作者開發了一個FLAIR的分析流程,對以前的分析方法進行優化,該方法可以提高剪接位點識別的準確性,同時具有更高的靈敏度和精確度。

3′末端剪切分析

以前使用Illumina的數據在37個CLL樣本17(24個SF3B1WT和13個SF3B1突變)中鑒定到65個3′末端剪切發生了顯著改變。使用Nanopore數據鑒定到的這些3′末端剪切的dPSI與二代的做比較,隨著測序深度的增加,二者的dPSI越相似。Nanopore數據鑒定到35個備選3’可變剪接位點(其中2個位點以前有文獻報道)和10個5’ 可變剪接位點。
 



作者在以前發現的65個3′可變剪接位點上游發現了一個13-16bp 連續的A序列,這與其他SF3B1突變研究結果一致。長序列不僅能夠識別突變的SF3B1改變的剪接位點,而且還可以與其他mRNA前體的成熟過程中的異常關聯。
 


差異內含子保留分析

內含子保留(IR)在腫瘤組織和正常組織中有著非常大的差異,不過短序列很難檢測,特別在復雜AS57的區域。長序列可以跨越多個外顯子和內含子,可以檢測連續的多個AS(包括IR),更容易識別和量化IR。使用Nanopore數據分析發現,SF3B1K700E(突變株)中的IR異構體相對SF3B1WT(野生型)表達整體下調(其中70個差異顯著,Illumina序列沒有檢測到),同時可以檢測到IR同步的外顯子跳躍的異構體。B細胞與SF3B1K700E的IR異構體的表達整體無明顯變化。對以前CLL短讀長數據的在進行分析證實了CLL-SF3B1WT觀察到的IR, SF3B1K700E較SF3B1WT相對減少但是差異不顯著。對已經發表乳腺癌樣本(無常見剪切因子突變)與SF3B1K700E的數據再進行分析,也發現同樣的趨勢。
 



差異內含子保留的剪接位點分析

從CLL短讀長識別出的IR中,作者發現在3′末端剪切位點上游15bp處有一個TGAC分支的Motif,在其他研究中也有報道,不過位置不完全相同;Nanopore數據未識別到剪接位點,可能是序列錯誤率較高造成。作者使用組裝的轉錄本和異構體定量,鑒定到143個全長異構體,其中53個在野生型和突變株中存在顯著差異(包含5個3′末端剪切位點,1個5′末端剪切位點,8個保留內含子和28個外顯子跳躍),其中FLAIR識別出多個剪切類型。SF3B1K700E較SF3B1WT,基因LINC01089、LINC01480、XBP1內含子保留的異構體表達降低。這些IR異構體與3′末端剪切耦合,這種耦合很難用短讀長檢測到
 

編碼和非編碼內含子保留異構體分析

短讀長研究發現CLL中的突變株預測與提前終止密碼子(PTCs)增加有關。通過全長cDNA測序,能夠更好地檢測(而不是預測)PTCs轉錄本的比例。因此相對短序列,全長cDNA序列更容易識別編碼和非編碼異構體,作者的結果與已經報道的數據結果一致,同時可以發現5個新的異構體。并且大多數由局部變化預測的這種異構體與全長一致,只有少部分例外。同時檢測到相對于野生型,突變株的非編碼內含子保留異構體下調。


結論

基于Nanopore的全長cDNA測序可以檢測轉錄本全長,通過算法優化,相對于短序列,可以更準確的檢測3′末端剪切,內含子保留,分辨生產性異構體和非生產性異構體。該工作證明了Nanopore測序在癌癥和可變剪切中的潛在使用價值。
 
參考文獻
Tang AD. et al. Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns. Nature Communications 2020;11(3) :1-12.
 
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